单细胞分析技术在干细胞异质性研究中的应用(2)

微孔法可以不用特殊的缓冲液，不依赖细胞标志物的表达水平，且操作方法简易，通过精准设计芯片中微通道与捕获微结构，实现目标单细胞的高通量捕获，而且单细胞的固定捕获位点可以进一步进行实时观察与追踪分析。传统的微孔芯片已被证明可用于筛选干细胞的蛋白质/基因标记物，但存在加工难度较大、成本较高、交叉污染、费力等问题，且必须手动冲洗芯片[9]。对于某些应用研究中，少量细胞易附着在孔的倾斜壁上。还很多研究缺乏自动检测功能(例如用于自动x/y运动的平板读数器或编程显微镜表)，限制了在合理时间范围内可检测井的数量[10]。

(2)微滴法(液滴微流控捕获法)：微流控技术是在微通道网络中产生纳升至皮升级的液滴，将单个感兴趣的细胞包裹后置于液滴内。该装置的核心是只容许单个细胞通过的通道，其直径可根据细胞的大小进行调节，并且通道可根据需要检测的细胞类型进行修饰。实验中为了减少流体用量、提高样品浓度，可以将微流控装置结合到生物芯片上[11]。此技术利用了物理学上可以在微米级尺度上忽略流体惯性的原理[12]，人为控制细胞流体的流动，来实现单细胞的分离[13]，每个液滴能够满足多种目标单细胞检测的研究，并能高效地避免交叉污染。在微灌注系统的辅助下，微流控芯片已经可以实现动态细胞培养作为恒化器。目前，微流体细胞培养设备已用于干细胞增殖和分化[14]，已经有很多科学家在微流控芯片内成功培养了干细胞[15-17]，并可以模拟细胞之间的相互作用。十字型流体聚焦法和T型通道法是生成微液滴最常见的方法，两者都可通过调控两相流速获得性质稳定、大小均一的液滴。用于包裹单个细胞的液滴一般用油包水的形式来处理，以保证细胞存活与生物相容性[18]。

当前的微流体技术已经加强了对细胞谱系的研究，但在微流体内单独检索姐妹细胞进一步分析的技术未完善，还不能排除单细胞或单独回收的细胞之间的相互作用，仍具有进一步分析的特异性[19]。液滴微流控捕获法的单细胞捕获芯片成本低、捕获速度快，且消耗的试剂和样品量较少，适用于需要将单个细胞和相关试剂单独包裹在微液滴再进行单细胞检测分析的研究。但此方法在单个液滴内没有或存在多个细胞包裹的现象，在包裹细胞后微液滴位置不易固定，不利于实时观察。

(3)单光束激光捕获法：单光束激光捕获技术是一种通过高度汇聚的激光束形成三维势阱，通过束腰附近存在强大的梯度力捕获并移动单个细胞的技术[9]，见图1。通过调节光束，能够精准地利用光镊捕获细胞群中的单个细胞，再将目标细胞移动到特定的位置进一步分析检测[20]。

图1 微流控液滴生成与单细胞包裹图[9]

光镊捕获技术在完全密封的容器内进行，具备在微米级范围内定位的能力，能在不接触细胞的情况下，精确地捕获并移动单个细胞，不易污染且不会损伤细胞。但是，该技术成本较高，对设备要求高，不适用于高通量的单细胞捕获和分析。

(4)介电电泳捕获法：介电电泳现象是非均匀电场中介电粒子被极化而受力产生的定向移动[21]。在不同电极结构产生不同的非均匀电场下，介电粒子会根据正介电电泳力(p-DEP)或负介电电泳力(n-DEP)的作用向高电场或低电场运动，最终在相应的部位被捕获和固定，实现了粒子的有效操控[22]。而介电粒子的细胞在非均匀电场时，只需改变施加电压的大小和频率等条件，细胞便可通过所受到的介电电泳力来移动。当前，微流控芯片技术与介电电泳操纵技术的结合，得到了可靠的单细胞研究平台[23]。

介电电泳技术可以进行实时观察，并且捕获效率高、操作简单、对细胞损伤小。但是，这种方法需要特殊的缓冲液，精准设计电极结构与分析细胞所受到的介电电泳力，在确保细胞活性的同时实现高效地捕获单个目标细胞。

2.1.3 单细胞机器人技术 将单个靶细胞与细胞群分离，对建立高产细胞和进行细胞分析非常重要。传统的细胞筛选方法广泛地使用荧光激活细胞分选仪(FACS)，但荧光激活细胞分选仪不能用于靶细胞含量百分比< 0.1%的样品，且不能基于细胞特性的时间依赖性变化对细胞进行分类。单细胞操纵支持机器人(SMSR)是一种用于在活细胞中显微注射特定基因和蛋白质以分析它们各自功能的有用机器。但传统的单细胞操纵支持机器人有较大缺陷。MATSUOKA等[24]将单细胞操纵支持机器人应用于显微注射到水稻原生质体和小鼠胚胎干细胞中。结果表明对这些细胞的显微注射比通常的动物细胞如成纤维细胞更困难。因此，TATEMATSU等[25]开发了新的自动单细胞分析和分离系统(单细胞机器人)，可以对具有最高多能性的干细胞进行高通量筛选，可以促进单个细胞的非侵入性分离，从含有>105个细胞的阵列中获得最有利的特性，从而可以为生物药物建立新的细胞筛选方法。单细胞机器人在2013年成功开发并实现商业化[26]。

文章来源：《造纸科学与技术》 网址: http://www.zzkxyjs.cn/qikandaodu/2021/0128/331.html