单细胞分析技术在干细胞异质性研究中的应用(3)

单细胞机器人作为一门高通量筛选的新兴技术，较微流体技术在操作上更简便，未来将更广泛的应用于干细胞领域。

2.2 单细胞分析技术 在过去的几年中，各种单细胞技术揭示了体外和体内不同干细胞群体的异质性，这些技术涵盖了从单个细胞的基因组学分析[27]、全转录组学分析和蛋白质组学分析[28-30]。近几年随着单细胞蛋白质组学分析和RNA测序发展迅速，单细胞分析检测技术被广泛用于不同细胞类型的鉴定与发现。该技术推进了蛋白质功能与特征的研究，为单细胞异质性的分析与鉴定奠定基础。通过质谱流式技术，结合多种表面抗体和胞内抗体，为细胞图谱绘制提供了表型数据。这些技术提供了大量关于组织内细胞异质性的信息，但它们无法提供细胞动力学的任何信息，因为它们代表单个细胞快 照[31]。新技术的最新发展旨在整合细胞的转录组学特征和它们的空间位置。

2.2.1 单细胞DNA分析技术 单细胞DNA分析技术是通过高通量测序平台对生物基因组中的基因进行测序，测定其DNA的碱基序列。该技术可在基因组水平上检测单核苷酸变异、插入缺失、拷贝数变异和结构变异等多种突变信息。

相同个体不同细胞间基因的组成与突变存在着差异，而鉴定细胞的类型与解决细胞异质性的重要方法是分析单个细胞的表观遗传信息和DNA。单细胞DNA测序技术检测包括外显子组测序、靶向重测序、全基因组测序等。全基因组测序可以获得整个基因组的信息，用于检测DNA变异、插入或缺失和拷贝数的改变，为当前应用广泛的单细胞测序分析技术[6]。

在2012年，ZONG等[32]提出了多重退火与成环循环扩增技术(MALBAC)，在添加引物进行拟线性扩增后，再进行指数扩增。这种方法降低了序列的偏好性，并能覆盖单个细胞绝大部分的基因组。在2014年，HAN等[33]报道了微流体促进的方法，允许控制分离单个细胞的细胞质和核内容物，然后片上扩增基因组DNA和细胞质mRNA。当与片外聚合酶链反应、凝胶电泳和Sanger测序结合时，可以共同检测和测序来自相同单细胞的一组基因和转录物。在2017年，VITAK等[34]利用单细胞组合标记技术(SCI-seq)分析了单个目标细胞拷贝数的变异(CNV)，利用锂辅助核小体耗尽(LAND)和SDS交联(xSDS)方法，清除了与DNA结合的蛋白质，同时保证了细胞核的完整性，得到了较为精准的CNV测序结果。这种方法可同时建立上千种低通量的单细胞CNV检测文库，可同时分析大约10 000个单细胞，极大地降低了文库的构建成本，并增加了检测通量。这种方法可应用于单细胞检测和不同类型细胞的表观遗传差异，为解决干细胞领域诸多问题例如异质性开辟了新的机会，有助于解决干细胞治疗的临床挑战。

2.2.2 单细胞RNA分析技术 RNA检测技术可以检测样本中所有的RNA转录本，开展基因表达分析或发现新型RNA。但是，测序的对象往往是细胞群或组织样本，这使细胞之间的差异可能会被细胞群的总体平均值所掩盖。

通过同时测量多个相关基因的mRNA水平，可以分析共同控制细胞事件调节的潜在基因相互作用，在理想情况下，应该研究单个细胞，以便与其他细胞进行比较。单细胞RNA-seq技术是根据基因表达谱来对细胞进行鉴定和分析。单细胞RNA测序技术有2种，一种是先反转录为cDNA，再通过二代测序技术进行测序；另一种是通过单分子测序技术，直接对RNA分子进行分析[6]。

高通量单细胞RNA测序技术需结合高效的单细胞分离技术和后续准确的测序分析。KLEIN等[35]利用微流控技术把带有条码的微珠与细胞装入微小的液滴内，建立了快速、高通量的单细胞RNA-seq方法。将细胞捕获入由反转录试剂、溶解液与条码标记的寡核苷酸引物组成的微滴内，在微滴中溶解细胞，释放mRNA，再通过条码标记的寡核苷酸引物将其合成出有标记的cDNA，接着利用CEL-seq对释放出的cDNA进行测序。在2013年，TANG等[36]开发了新的单细胞RNA-Seq技术，利用寡(dT)引物将含有poly(A)尾的mRNA反转录成cDNA，通过将cDNA片段从3'末端限制为0.85 kb来实现定量准确性，这相当于所有全长cDNA约7%，通过延长反转录的孵育时间和PCR的延伸时间可以将cDNA长度增加到3 kb并不会降低计数mRNA拷贝数的准确性。能够捕获大部分表达基因的全长cDNA，在相同细胞周期阶段的单细胞中，数百个基因同时表达至少2种转录物同种型。在2014年，STREETS等[37]提出了一种基于微流体的系统，用于从单个细胞制备cDNA和RNA测序，具有更高的精确度和灵敏度，通过微流体平台与单细胞全转录组分析的高通量测序相结合解决了这些局限性。对提取的总RNA和62个单小鼠胚胎细胞进行了技术重复测序，以对该技术的性能进行基准测试，使用TANG团队[36]的方案进行反转录和cDNA扩增，并显示出精确度和灵敏度的提高。2016年HABIB等[38]根据Nuc-Seq技术(一种高通量的单核单细胞RNA测序技术)开发了适用于神经细胞的Div-Seq技术，用于固定后或冰冻的神经细胞检测。HABIB等[39]继续开发了DroNc-Seq单核RNA测序方法，可以进行大规模的单细胞RNA测序，能够应用于复杂样品的测序。高效灵敏的测序技术是鉴定细胞类型的利器，2017年VILLANI等[40]通过单细胞RNA测序技术发现了新的人血树突状细胞和单核细胞。

文章来源：《造纸科学与技术》 网址: http://www.zzkxyjs.cn/qikandaodu/2021/0128/331.html