单细胞分析技术在干细胞异质性研究中的应用(4)

2.2.3 单细胞蛋白质组学分析技术 蛋白质组学是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包含蛋白质表达水平、翻译后修饰以及蛋白之间的相互作用等，得到蛋白质水平上有关细胞代谢、疾病发生机制等过程的全面认识。

从单细胞层面了解细胞特征与彼此之间的影响，可为生物系统细胞间的异质性提供可靠的信息。单细胞蛋白质组学技术是后基因组计划之一，单个细胞的蛋白质作为生命体内功能的直接执行者，与基因相比更有意义去揭示生命发育的发生发展的机制。该技术对单个细胞的蛋白质表达种类与表达量进行检测，分析不同细胞的表达差异，鉴定细胞类型。干细胞的单细胞蛋白质分析对了解细胞间异质性与细胞信号通路有很大作用[30]。

常用的单细胞蛋白质组学检测技术包括流式细胞技术和化学蛋白质组学。化学蛋白质组学采用化学探针研究蛋白质功能和机制。单细胞蛋白免疫印迹可以直接检测单个目标细胞内特定蛋白的表达水平或通过抗原抗体反应对细胞群分类筛选，来实现对单个目标细胞的蛋白质组学分析。流式细胞技术可以将细胞群在流体力学和超声波的作用下形成单细胞阵列通过激光束，使细胞通过激发的信号被检测器快速捕获，再根据细胞大小、荧光标记抗体等对单细胞表面或胞内蛋白进行筛选、鉴定、定性和定量分析，具有速度快、灵敏度高和准确度高的特点，是目前单细胞分析的重要手段。

随着单细胞高通量技术的发展，通过将蛋白质组学分析与活体成像和谱系追踪研究相结合，可以了解与周围微环境相关的哺乳动物干细胞行为[41]。多种技术的相互结合有助于在稳态条件、组织修复与微环境中调节干细胞活性并探索和揭示其新的机制[42]。

2.2.4 单细胞机器人分析技术 多基因和相关因子的相互作用参与胚胎干细胞的去分化与分化。这些基因和因子的定量分析对于阐明其机制至关重要。单细胞分析是生物医学科学中的一个新兴领域，需要具有不同分析能力的同等范围的仪器设备[43-44]。随着纳米技术的不断发展，基于原子力显微镜的纳米级别的操作机器人技术在单细胞等领域取得了极大成功。

已经被开发与应用的RoboSCell是一种高通量、基于单细胞微阵列的机器人仪器[43]。该仪器采用与机器人生物操纵器集成的部分透明单细胞微阵列(SCM)，用于体外分析捕获在阵列位点的活单细胞。在透明单细胞微阵列中通过封装的坡莫合金通道引导磁场，在阵列位置捕获用免疫磁性粒子标记的细胞。RoboSCell将为动态单细胞分析提供准确和有效的手段。YASUKAWA等[45]在2002年根据单细胞微阵列开发了用于使细胞保持特定状态的装置，便于单个细胞更精准的分析。MATSUOKA等[24]在2005年开发了一种单细胞操纵支持机器人(SMSR)，让操作员专注于显微注射，并在2007年研究了用于小鼠胚胎干细胞的高效显微注射的各种实验条件，成功证明了小鼠胚胎干细胞中EGFP基因表达的半定量控制及其敲低[46]。总而言之，目前单细胞操纵支持机器人的性能已经满足具有亚微空间分辨率的活胚胎干细胞中的动态基因表达分析。

新的自动单细胞分析和分离系统(单细胞机器人)极大地丰富了应用于干细胞的单细胞分析，但自动细胞检测和跟踪是高通量分析的主要瓶颈[47-48]，这对于准确评估细胞的形态特征和迁移模式是必不可少的，并且在很大程度上减少了主观偏倚。在将来，随着自动细胞检测和跟踪技术的提高，单细胞机器人将发挥更大的作用。

2.2.5 相关技术在干细胞研究中的应用 干细胞是具有无限自我更新能力的细胞，可以演化成表型不同的细胞群。受细胞分化、克隆演化和微环境等因素影响，导致表型与功能的异质性。通过流式细胞仪把中脑多巴胺能神经元分为多个亚群，包括A8亚群、A9亚群、A10亚群和5-HT亚群等。已知只有A9中脑多巴胺神经元可以治疗帕金森病，但现有的分化方案尚未克服异质性问题，影响体内移植，是细胞源性多巴胺替代疗法进入临床的难点。单细胞分析对了解干细胞中的异质性至关重要，而微流控芯片是一种在高分辨率下比较测量和表征整个转录组模式的有效方法[49]。

在2009年，GLOTZBACH等[50]开发了一种微流体技术应用，结合信息理论的分析原理，定义了单个细胞的转录特征，并提供了辨别单细胞水平有意义的变异(信号)的能力。通过这种方法，检测到小鼠长期造血干细胞(LT-HSC)群体中基因表达谱的变化，并确定了几个转录定义的亚群，这些亚群与长期造血干细胞的已知功能异质性一致[51]。该方法在组织和器官水平上定义复杂细胞群体的转录组织的效用，以阐明转录和表型变异之间的关系。在2011年，MOON等[52]提出了一种基于微滴的方法，从异质细胞悬浮液(10%靶细胞混合物)中分离提取单细胞，可以保留提取细胞的活力(约97%)，并从非分离细胞获得基因组信息-图案控件。在分离的细胞1 000个基因中鉴定出11个干细胞标记物，并与对照组进行比较。与现有的方法相比，这种自动化平台能够更有效地进行高通量细胞操作，以进行后续的基因组分析。微流体实时阵列已被用于人类诱导多能干细胞的基因表达谱分析[53]，通过分析大型多能性和分化标记物的表达，为定量评估人类诱导多能干细胞的特征提供了一个新平台。WHITE等[49]提出了一个完全集成的微流体装置，能够执行每次运行数百个单细胞的基因表达的高精度RT-qPCR测量。在超过3 300个单细胞实验中，黏附和悬浮细胞系以及临床样品中精确比较了GAPDH和miR-16表达的分布，发现miR-16在K562细胞中被精确调节。该装置以纳升体积处理降低了测量噪音，提高了灵敏度，并提供了单核苷酸特异性，为干细胞的微流体单细胞转录分析奠定了基础。在2012年，SANCHEZ-FREIRE等[54]描述了用于评估单个多能细胞中基因表达谱的微流体平台，可以提供关于定义细胞群(例如人类诱导多能干细胞集落)内多能性变化的重要信息。该技术仅需要提取和表征相对少量的细胞，允许通过体内成像在动物模型中监测人类诱导多能干细胞增殖和存活方面的深入分析，可以直接比较人类诱导多能干细胞和人胚胎干细胞基因表达谱[53]。

文章来源：《造纸科学与技术》 网址: http://www.zzkxyjs.cn/qikandaodu/2021/0128/331.html